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Asiento asignado por el Registro Nacional de Asociaciones Español: Grupo 1º, Sección 1ª, Numero 600121 - NIF: G76556646 ...


La Raíz - Técnicas y Procesos - La Planta - Cánnabis



     


 Identificación de los componentes de las raíces 

 Introducción 

Las raíces son la parte menos estudiada de la planta del cannabis, aún así, desde la década de los 70, han sido identificados varios componentes y compuestos. Aunque la producción de los pelos glandulares, están donde la mayoría de los cannabinoides, por inmunoensayos y análisis químicos también han sido detectados en las raíces.

Se han detectado y aislado terpenos en el aceite esencial de flores, hojas y las raíces. Los terpenos son responsables del sabor de las diferentes variedades del cannabis y determinan la preferencia de los consumidores de cannabis.

Los alcaloides son otra clase de componentes químicos que se han encontrado en el cannabis. La piperidina y la pirrolidina fueron aisladas e identificadas en las raíces, hojas, tallos, polen y semillas. También se han constatado la biosíntesis de colina y atropina por las culturas de raíces peludas. El análisis de las nueces y raíces del cannabis han revelado 11 compuestos identificados como amidas fenólicas y lignanamides.

Una revisión logro establecer la presencia de lignanos cuales ostentan suaves efectos insecticidas (anti-paracitarios) y, amidas fenólicas las cuales son determinantes por su efecto citotóxico y anti-inflamatorio, su actividad antineoplásica, analgésica y cardiovascular.

El trabajo realizado en este estudio, se baso en estudios de literatura crítica y reciente (2007) sobre la raíz de cannabis, se extrajeron los alcaloides y los compuestos presentes en las raíces de una variedad medicinal de cannabis (Bedrocan) fraccionándolos con el fin de detectar los componentes biológicamente activos, mediante bioensayos de fraccionamiento guiada. Por la limitada disponibilidad del tiempo disponible (6 semanas) se decidió por el prueba de acetilcolina esterasa, la cual reacciona con manchas blancas sobre un fondo amarillo, para llevar a cabo el ensayo bioactividad,. Como un positivo (reactivo) fue utilizado el alcaloide galantamina

 Identificación de los componentes de las raíces 

 Materiales y Métodos 

Todo lo descrito a continuación se muestra esquemáticamente en la figura 1 del apéndice figura.

Los disolventes y productos químicos
Todos los disolventes orgánicos fueron de grado analítico y obtenidas de Merck Biosolve Ltd. Valkenswaard, Holanda.

  • Deuteriated cloroformo (CDCl3, 99,8%) Eurisotop (Gif-sur-Yvette, Francia)
  • agua (D20) Eurisotop (Gif-sur-Yvette, Francia)
  • Metanol (MeOD), Eurisotop (Gif-sur-Yvette, Francia)

Equipamiento general utilizado

  • Rotavapor: RotarVap R-200, Büchi
  • Speed Vac: SPD 121P, la Corporación ThermoElectron
  • Centrífuga Varifuge 3.0 R, Heraeus Sepatech
  • Secador en frío: Modulyo, Edwards
  • Sonicator: 5510, Branson
  • Blender: Blend-o-matic, Waring
  • UV Espectrofotómetro: Reprostar II, Camag

El material vegetal y la extracción

Material de raíz fresca (ver foto derecha) se obtuvieron de Bedrocan BV, Países Bajos, y se almacena a -20 º C hasta su uso. Las raíces se secaron al aire y luego se pulveriza en nitrógeno líquido. El resultante polvo se liofilizó y se pesó para determinar el rendimiento.

El polvo resultante Polvo (13 g) se sometio a una extracción secuencial con cuatro diferentes disolventes de polaridad creciente: hexano, cloroformo, acetona y metanol (extractos: A, B, C, D, respectivamente). Cada extracción fue preformada dos veces con 200 ml de disolvente, mientras que se sometió a sonicación durante cinco minutos. Para cada disolvente, ambos extractos se combinaron y se filtraron sobre papel.

Del polvo de la misma raíz, luego se extrajo sus componentes hirviéndolo durante treinta minutos con agua. El extracto de agua resultante, se filtró sobre papel (extracto E). Los Extractos AD se concentraron bajo vacío en un Rotavapor hasta alcanzar los 10 ml, mientras que el extracto E se concentró en un liofilizador. Todos los extractos obtenidos fueron analizados por TLC. Los extractos B, C y D se combinaron (mezclaron) debido a una composición similar.

Preparativa para la Cromatografía Thin Layer (Thin Layer Chromatography)
Por eficiencia y rapidez, la muestra (20 μL) fue insertada manualmente utilizando un capilar en una placa de fase de gel de sílice Standard de 10×20 cm, N º (105554 F254 No.105554 F254 plate; Merck, Darmstadt, Germany) y desarrollado en cámaras saturación normales (tiempo de saturación de 15 minutos). El euyente era hexano/éter dietílico/ácido fórmico - 50:50:1 (v/v/v).

Después del desarrollo, se realizó la inspección visual bajo luz UV de 254nm y 366nm. Posteriormente, en general visualización de los compuestos se realizó por pulverización con reactivo de pulverización anisaldehído-ácido sulfúrico modificado, seguido por calentamiento con una pistola de aire caliente.

En algunos experimentos los reactivos de pulverización también utilizados fueron los siguientes:

Fast Blue B: 0,5% sal de azul B rápido (o-dianisidina-bis-(diazotado)-zinc sal doble) (Sigma) en agua
Dragendorf: Solución a subnitrato) bismuto 0.6gr en 2 ml conc. HCl y 10 ml de agua
Solución B: 6 gr KI en 10 ml de agua. Mezclar junto con 7 ml de HCl conc. HCl y 15 ml agua. Se diluye a 400 ml con agua

Preparativa la HPLC
Fracciones combinadas BD eran más fracciones por cromatografía de afinidad utilizando un sistema analítico HPLC (Shimadzu) bajo las siguientes condiciones:

Columna:Phenomenex Luna C18, 5μm, 100Å
Eluyente:50% de metanol + agua 50%
Caudal: 4 ml/min
Amplitud de la fracción: 31 fracciones de 10 ml
Detección UV: 254 nm

Todas las fracciones obtenidas se analizaron por TLC y fracciones las 0, 14, 18 y 20 fueron seleccionados para su posterior análisis por ensayo de AchE.

Ensayo de inhibición de la acetilcolinesterasa (AChE)
Esta prueba se realizó de acuerdo con Rhee et al. (2001). Con este ensayo es posible detectar compuestos que inhiben la acetilcolina esterasa de una manera simple y rápida. La ventaja de este método de ensayo de TLC es que no existe perturbación de muestra disolviendo disolventes en la microplaca de ensayo.

Para realizar el ensayo fueron usadas las siguientes soluciones recién preparadas:

Solución Tampón A: 50 mM Tris-HCl, pH 8
Solución de sustrato/tinte: Yoduro 1mM Acetylthicholine (ATCI) + 1 mM 5,5 '-ditiobis-(2 - nitrobenzoico) (DTNB) en la solución tampón A
Solución de la enzima: 3U/mL de la acetilcolinesterasa (AChE) de la anguila eléctrica (tipo VI-s Sigma Chemical Co.) en solución tampón A

Fracciones investigados fueron vistos en la placa de TLC y se desarrollaron como se describió anteriormente. Después de su completo secado, se roció la placa con la solución de sustrato/colorante. Se deja secar la placa durante 3-5 minutos y luego se rocía con la solución de enzima.

Manchas activas se identificaron como manchas blancas sobre un fondo amarillo. Para controlar este ensayo fue utilizado como indicador de un control positivo el alcaloide de la galantamina.

La hidrólisis ácida
Fracción obtenida a partir de HPLC preparativa 0 se hidrolizo por calentamiento durante una 1 hora a 85 ° C en 1 ml metanol, 1 ml de agua y 0,2 ml de ácido clorhídrico. El metanol se evaporó bajo vacío de modo que solo sobraba el agua ácida. Los compuestos hidrolizados que ahora estaba presentes en el agua se extrajeron de entonces mediante la separación con 1 ml de etil-acetato, seguido de 1 ml de hexano.

Ambos compuestos orgánicos se combinaron y se procedió a su secado. El producto restante se redisuelvio en 1 ml de etanol y Analizado mediante un ensayo AChE.

Preparativa para la TLC
Las agliconas obtenidas tras la hidrólisis ácida, se fraccionó adicionalmente por preparativa Cromatografíca TL (De aquí en adelante denominado: TLC).

La muestra (20 μL) fue insertada manualmente utilizando un capilar en una placa normal de secuenciación de gel de sílice de 10×20 cm (placa N º 105554 F254 No.105554 F254 plate; Merck, Darmstadt, Germany) y desarrollado de cámaras saturación normales (tiempo de saturación de 15 minutos). El euyente uado era: hexano/acetato de etilo-1:1 (v/v).

Después del desarrollo, se realizó la inspección visual bajo luz UV de 254nm. Una pulgada de cada lado de la placa fue cortado para la visualización general de las bandas por pulverización con un reactivo anisaldehído- ácido sulfúrico modificación. La banda más intensa se raspó la placa, y la sílice obtenida extrajo con cloroformo. El extracto entonces se evaporo y volvió a disolver en CDCL 3 para su análisis por RMN.

El análisis de RMN
El análisis por RMN se usó varias veces durante el estudio, ya sea para determinar la pureza relativa de las fracciones o para identificar los componentes principales presentes en fracciones. 1H-RMN se registraron el CDCl3, D2O, y MeOD utilizando un espectrómetro Bruker DPX 300, equipado con un ordenador Indy Silicon Graphics.


Para cada muestra, se registraron 64 exploraciones con los siguientes parámetros:

Puntos de datos: 32K
Anchura del pulso: 4,0 μs y relajación retraso de 1 segundo
FID: Eran de Fourier transformado con LB a 0,5 Hz

Para el análisis cuantitativo, el área del pico fue utilizado después del inicio corrección.

 Resultados 

Es extrajeron y se fraccionaron los componentes de la raíz de la planta de Cannabis sativa L. con el fin de aislar e identificar posibles compuestos con un efecto inhibidor sobre la acetilcolina esterasa.

Después de limpiar y lavar las raíces, se pulverizaron y se secaron; el rendimiento fue de 26,06 gramos. Al hacerse las primeras extracciones el análisis por TLC, mostró compuestos similares en las fracciones BD y por lo tanto estas fueron combinadas.

A partir de ese punto las fracciones fueron renombradas como:

  • Fracción 1 (no polar, fracción A)
  • Fracción 2 (medio polar, fracción BD)
  • Fracción 3 (E polar, fracción). RMN

El análisis mostró que la fracción 1 estaba compuesta en su mayoría de lípidos, la fracción 2 contenida una mezcla de compuestos, y la fracción 3, que se compone en su mayoría de azúcares.

Las placas de TLC fueron rociadas con reactivo en aerosol b el cual con la presencia de cannabinoides con rapidez se torna azul, pero en este caso no se detectó ninguna reacción. Específicamente para detectar alcaloides se roció otro conjunto de placas de TLC con reactivo Dragendorf en aerosol, los resultados indicaron la posible presencia de alcaloides en la fracción 2.

El fraccionamiento inicial, de los compuestos presentes en la fracción 2, se realizó con Prep HPLC. El ensayo de acetilcolinesterasa que se realizó a las 31 fracciones detectar una actividad biológica posible, pero sólo con uno se obtuvo un resultado con un falso positivo. Además, no se pudo detectar la presencia de alcaloides después de rociar la muestra con reactivo Dragendorf. En este punto, el rastro de la bioactividad lamentablemente se perdió. Por lo tanto, se decidió centrarse en las fracciones con los compuestos más visibles y una consistencia más concentrada (en base a TLC).

Fueron seleccionados para el análisis las fracciones PLC: 0, 14, 18, 20 de RMN, y sus principales componentes fueron tentativamente identificados como:

  • Fracción 0: Glicósido de estructura desconocida
  • Fracción 14: Ácido graso saturado
  • Fracción 18: Ácido graso
  • Fracción 20: ácido graso insaturado

La fracción 0, fue la más interesante porque los glicósidos son a menudo biológicamente activos.

Dado que los glicósidos son difíciles de analizar en dicho estado, la fracción se hidrolizó para eliminar los grupos de azúcar y producir las agliconas libres. El ensayo AchE de fracción 0 se hizo en la fase orgánica, que contiene las agliconas, pero los resultados no fueron concluyentes.

Después de la fase orgánica se separó mediante la misma preparativa TLC, la banda más intensa (Rf valor: 0,49; ver figura 10) se raspó y se extrajo con éxito.

El último el compuesto aislado fue identificado por análisis de RMN como un tipo de lípidos (ver figura 11). Sin embargo, la identidad exacta no se pudo determinar debido a limitaciones de tiempo.

 Conclusión

La raíz del cannabis, como la parte subterránea de la planta, científicamente ha sido pasada por alto.

Aunque el tallo, las flores, las semillas y las hojas han recibido una cantidad abrumadora de atención, prácticamente hasta ahora casi nada ha sido publicado respecto a las raíces.

En este estudio se he intentado encontrar los compuestos de los extractos de raíz con un efecto inhibitorio sobre la acetilcolina Esterasa. A menudo los compuestos que muestran este efecto, pertenecen a la clase química de los alcaloides (Por ejemplo: la galantamina). También han sido detectados alcaloides en las raíces de cannabis, aunque a unos niveles muy bajos.

En las hojas secas la concentración de la colina y la neurine es sólo del 0,01%, esta podría ser la razón no se encontró alcaloides.

Las raíces son los órganos de almacenamiento primario de las plantas. El alto contenido de lípidos y azúcares presentes en las raíces de cannabis, puede haber complicado el aislamiento, el análisis y la identificación de componentes menores. En el paso final del fraccionamiento del bioensayo guiado, fue identificado un lípido.

Sin embargo, no está claro si esto es realmente un compuesto biológicamente activo o no, porque los resultados en el segundo ensayo de acetilcolinesterasa no fueron concluyentes. Por lo tanto, puede concluirse que el glucósido (fr.0 de la preparación de HPC) es el compuesto activo y como resultado de la hidrólisis se pierde su actividad. . Sin embargo, el resultado in-concluyente de la prueba AchE, finalmente también puedo ser debido a ácido residual a partir de la hidrólisis, todavía presentes en la muestra.

En conclusión no fue posible identificar claramente, en la raíz del cannabis, los compuestos con un efecto inhibidor sobre la acetilcolina esterasa. Es evidente que se precisan métodos analíticos más sensibles y selectivos y un una gama más amplia de bioensayos para seguir explorando el potencial medicinal de la raíz de la Cannabis sativa L.

©Traducido por DEMETER_MiMo2012

(PENDIENTE DE REVISIÓN Y RECTIFICACIÓN (Colaboraciones para dicho cometido son bienvenidas)

 Fuente:

El presente estudio es una traducciön elaborda por DEMETER a partir del estudio:

Caracterización de las propiedades medicinales de las raíces la Cannabis sativa L.

Titulo original: Characterization of Medicinal Properties of Cannabis Sativa L. Roots

Preparado para Lou E. Riesenberg, Profesor y Jefe del Departamento Educación y Extensión Agrícola, Colegio de Agricultura y Ciencias de la Vida Universidad de Idaho.

Autora de estudio: Blair Van Pelt

Trabajo realizado en el Departamento de Metabolómica de Vegetales, Instituto de Biología de Leiden perdenecientes a la Universidad de Leiden, Países Bajos 15 de diciembre 2008.

©DEMETER2012 - 27.05.2012 · Última vez editado: 17.07.2012



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